TYPY ADHEZJI SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI IZOLOWANYCH Z PRZYPADKÓW BIEGUNEK, Weterynaria Lublin, Weterynaria 1, ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
PRZEGL EPIDEMIOL 2001;55:287-97
Beata Magdalena Sobieszczańska
1
,
Romuald Gryko
2
TYPY ADHEZJI SZCZEPÓW
ESCHERICHIA COLI
IZOLOWANYCH Z
PRZYPADKÓW BIEGUNEK
1
Katedra i
Zakład
Mikrobiologii AM we Wrocławiu
Kierownik:
A. Przondo-Mordarska
2
Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii w Puławach
Dyrektor:
M. Bartoszcze
Zaobserwowana wśród enteropatogennych szczepów Escherichia coli
(EPEC) zależność między sposobem adhezji do komórek hodowlanych
in vitro a zdolnością do wywoływania charakterystycznych zmian histo­
patologicznych w komórkach nabłonka jelita, stała się podstawą reklasy-
fikacji tej grupy patogenów jelitowych.
WSTĘP
Pod koniec lat 70-tych Cravioto i wsp. (1) oraz inni badacze (2, 3) zaobserwowali,
że pałeczki
E. coli
należące do niektórych serotypów enteropatogennych (EPEC),
w teście in vitro przylegają do komórek linii HEp-2 lub HeLa w postaci charakte­
rystycznych skupisk, co określono mianem zlokalizowanej adherencji - LA (localised
adherence). W przeciwieństwie do nich pozostałe serotypy EPEC oraz wiele niepato-
gennych szczepów
E. coli
wykazuje in vitro rozsiany typ adhezji - DA (diffuse adhe­
rent), w którym pojedyncze bakterie przylegają do całej powierzchni komórek (2).
Badania Levine i wsp. (4) wykazały, że zlokalizowany typ adhezji związany jest z
obecnością plazmidu (60 MDa), który nazwano czynnikiem adherencji
E. coli -
EAF
(E. coli
adherence factor) (5, 6). Plazmid EAF koduje fimbrie BFP (bundle forming
pili), mające zasadnicze znaczenie w procesie adhezji szczepów LA. Badania wykonane
na ochotnikach ujawniły związek pomiędzy obecnością czynnika EAF a zdolnością
szczepów
E. coli
do wywoływania biegunki (7). Szczepy wyleczone z tego plazmidu nie
wykazują adhezji typu LA i są znacznie mniej chorobotwórcze dla ludzi (8). Następnie
wykazano, że szczepy
E. coli
EAF-dodatnie tworzą in vivo na błonie śluzowej jelita
takie same skupiska (mikrokolonie) bakterii, jak te obserwowane in vitro oraz, że
większość tych szczepów wywołuje w enterocytach charakterystyczne zmiany histopa­
tologiczne tzw. przylegania i zacierania struktury kosmków jelitowych - AE (attaching
and effacing) (7, 9). Zmiany AE charakteryzuje ścisły kontakt bakterii z enterocytem,
zniszczenie rąbka szczoteczkowego w miejscu adhezji bakterii oraz zniszczenie cyto­
szkieletu komórki. W miejscu adhezji bakterii błona cytoplazmatyczna komórki ulega
wyniesieniu, tworząc strukturę podobną do piedestału, wewnątrz której gromadzą się
włókna aktyny i inne białka cytoszkieletu (9, 10, 11). Za zdolność szczepów
E. coli
do
288
BM Sobieszczańska, R Gryko
Nr 3
wywoływania zmian AE odpowiada chromosomalny gen
eae,
kodujący bakteryjne białko
błony zewnętrznej - intiminę, bezpośrednio odpowiedzialną za reorganizację cyto-
szkieletu enterocytów (10). Na podstawie obecności czynnika EAF oraz zdolności do
wywoływania zmian patologicznych w enterocytach, grupę EPEC podzielono na kla­
syczne EPEC (I grupa) i nieklasyczne EPEC (II grupa). Klasyczne EPEC, obejmujące
serotypy: 026, 055, Ol11, Ol19, 0126, 0127, 0142 charakteryzuje typ adhezji LA
oraz zdolność wywoływania zmian AE. Szczepy
E. coli
należące do II grupy (nieklasy­
czne), obejmujące m.in. serotypy 044, 086, 0114, nie mają zdolności wywoływania
zmian AE (brak genu
eae)
oraz wykazują rozsianą adherencję lub należą do szczepów
nieadherentnych (2). Poza EPEC zdolność do wywoływania zmian typu AE, związaną
z obecnością genu
eae,
wykazano także m.in. u enterokrwotocznych szczepów
E. coli
(EHEC). EHEC, do których należą niektóre serotypy zaliczane równocześnie do EPEC
np.: 026 i Ol11 oraz inne serotypy m.in. 0157, poza tym, że mogą produkować
verotoksyny, charakteryzują się obecnością plazmidu o ciężarze cząsteczkowym podob­
nym do plazmidu EAF, ale oznaczonym p0157, który koduje fimbrie odpowiedzialne
za adhezję i ekspresję enterohemolizyny (12, 13).
Celem pracy była charakterystyka typów adhezji szczepów
E. coli
izolowanych
z przypadków biegunek oraz porównanie typu adhezji z obecnością: plazmidu 60 MDa,
fimbrii adhezyjnych, genu
eae
oraz zdolnością badanych szczepów do wywoływania
zmian w cytoszkielecie komórek hodowlanych w teście in vitro.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na 96 szczepach
E. coli
izolowanych w latach 1998 - 1999
z próbek kału od 94 dzieci z biegunką (średni wiek dzieci 3 miesiące), hospitalizowa­
nych w Klinice Pediatrii AM we Wrocławiu. W badaniach wykorzystano tylko te próbki
kału, w których w rutynowym badaniu bakteriologicznym nie stwierdzono innych pa­
togenów jelitowych (Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter spp, Yersinia spp,
Rotavirusy). Jako kontrolę dodatnią zastosowano referencyjny szczep
E. coli
026:H11
(H-19) EAF i
eae
- dodatni wykazujący zlokalizowany typ adhezji (LA) oraz referen­
cyjny szczep
E. coli
0157:H7 (EDL 933) p0157 i
eae -
dodatni, posiadający geny dla
verotoksyn
(stxl
i
stx2),
produkujący enetrohemolizynę i nie wykazujący adherencji do
komórek linii HEp-2. Szczepy izolowano z posiewu próbek kału na podłoże Mac
Conkeya. Przynależność gatunkową badanych szczepów potwierdzano testem bioche­
micznym ID GN32 (bioMerieux).
Serologiczną identyfikację badanych szczepów (18-godzinne hodowle na agarze
zwykłym) przeprowadzano metodą aglutynacji szkiełkowej z zestawem diagnostycznych
odczynników lateksowych wieloważnych i jednoważnych dla enteropatogennych pałe­
czek Escherichia coli (EPEC) (P.W. Biomex, Kraków) oraz z odczynnikiem lateksowym
(Oxoid) dla
E. coli
0157.
Fimbrie adhezyjne oznaczano metodą hemaglutynacji 3% zawiesiny krwinek czer­
wonych świnki morskiej oraz ludzkich grup A i O, w obecności i nieobecności D -
mannozy, wg Evans i wsp. (14). Pałeczki
E. coli
wytwarzające mannozooporne fimbrie
(MR) aglutynują krwinki w obecności i nieobecności D - mannozy, natomiast szczepy
posiadające fimbrie mannozowrażliwe (MS) aglutynują krwinki tylko w nieobecności
D - mannozy.
Nr 3
Typy ahezji
E. coli
289
Test adhezji in vitro do komórek linii HEp-2 wykonano wg I.C. Scaletsky i wsp.
(15).
Hodowlę komórek HEp-2 prowadzono w podłożu MEM z L-glutaminą, 10% suro­
wicą cielęcą i roztworem antybiotyków (penicylina 100 U, streptomycyna 100 U,
amfoterycyna B 0,25 ug/ml), w temp. 37°C w atmosferze 5% C0
2
. Podłoże i suple­
menty pochodziły z firmy Gibco BRL. 24-godzinną hodowlę komórek HEp-2 (mono-
layer) w kamerkach 2-komorowych na szkiełku mikroskopowym (NUNC), płukano
2-krotnie w PBS (pH 7,2) z 0,5% D-mannozą; następnie dodawano świeże podłoże
MEM z 2% surowicą cielęcą, 0,5% D-mannozą, bez antybiotyków. Tak przygotowane
komórki zakażano 18-godzinną hodowlą badanych szczepów w LB (Luria broth,
Difco) w temp. 37°C z napowietrzaniem. Po 3-godzinnej inkubacji w temp. 37°C
i w atmosferze 5% CO2, komórki płukano 6-krotnie w PBS i utrwalano przez 30 min.
100% metanolem. Po 3-krotnym odpłukaniu w jałowej wodzie destylowanej, komórki
barwiono 4-5 godzin metodą Giemza. Badanie wykonywano dwukrotnie dla każdego
szczepu. Ponadto dla szczepów, które nie wykazały adhezji po 3 godzinach inkubacji
z komórkami, test powtarzano, przedłużając czas inkubacji do 6 godz. Wynik odczyty­
wano w mikroskopie świetlnym, w układzie imersyjnym, przy powiększeniu 1000-krot-
nym. Badany szczep uznawano za zdolny do adhezji, gdy 80% komórek HEp-2
wykazywało przylegające bakterie.
Izolację plazmidowego DNA wykonano wg metody Birnboim i Doły (16).
Analizy ciężarów cząsteczkowych plazmidów badanych szczepów dokonywano w sys­
temie do analizy żeli GelDok 2000 (BioRad), w programie Quantity One, w odniesie­
niu do wzorcowego szczepu
E. coli
V517, posiadającego plazmidy o znanych ciężarach
cząsteczkowych.
Test FAS (fluorescence actin staining), pozwalający na wykazanie zdolności bada­
nych szczepów do wywoływania zmian typu AE, wykonano zgodnie z metodą opisaną
przez Knutton i wsp. (17), na linii komórkowej HEp-2.
Sekwencje nukleotydowe, swoiste dla genu
eae
oraz genów dla verotoksyn VT1
i VT2 (przedstawione w tabeli I), wykrywano metodą PCR (polymerase chain reaction)
według Linqvist i wsp. (18).
Tabela I.
Primery zastosowane w PCR do amplifikacji fragmentów specyficznych dla
genów verotoksyn VT1 i VT2 oraz genu
eae
Table I.
Primers used in PCR to amplify specific fragments from genes for VT1, VT2,
and
eae
Primery
VT1 a
VT1 b
VT2 a
VT2 b
eae -
1
eae - 2
Sekwencje oligonukleotydowe (5'-3')
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
AGCGATGCAGCTATTAATAA
TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
ACCGTTTTTCAGATTTT(AG)CACATA
CACACGAATAAACTGACTAAAATG
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT
Ciężar cząsteczkowy (bp)
130
298
376
290
BM Sobieszczańska, R Gryko
Nr 3
Zdolność do produkcji enterohemolizyny oznaczano na podłożu tryptozowo - sojo­
wym z 10 mM CaCl
2
i 5% zawiesiną krwinek baranich trzykrotnie płukanych w PBS
(pH 7,2) według Beutin i wsp. (19).
WYNIKI
Wśród przebadanych 96 szczepów
E. coli
izolowanych z próbek kału dzieci z bie­
gunką, zlokalizowany typ mannozoopornej adhezji (LA) wykazało 9,4% szczepów, typ
podobny do zlokalizowango (LAL) 9,4%, rozsiany (DA) 46,8%, natomiast 28,1%
szczepów nie wykazało mannozo-opornej adhezji do komórek linii HEp-2 (NA); w
przypadku 6,2% szczepów stwierdzono odrywanie komórek od szkła, zarówno po 3 jak
i 6 godz. inkubacji; prawdopodobnie były to szczepy „odrywające" CDEC - cell deta-
ching
E. coli.
Wyniki badania zależności pomiędzy typem adhezji, serotypem a obec­
nością fimbrii typu MR i MS przedstawiono w tabeli II. Obecność genu
eae
wykazało
25 (26%) badanych szczepów. Wszystkie te szczepy były zdolne do wywoływania zmian
w cytoszkielecie komórek, co wykazano w teście FAS. Zlokalizowany typ adhezji
(rycia) dotyczył szczepów
eae
i FAS - dodatnich, należących do serotypów: 026 (6
szczepów), OH4 (1 szczep) oraz 1 szczepu szorstkiego, który aglutynował z 3% rozt­
worem NaCl. Szczepy te wykazały również obecność plazmidu około 60 MDa. Typ
adhezji podobny do zlokalizowanej (ryc.lb), charakteryzują luźne skupiska bakterii
przylegające tylko do nielicznych (11 - 25%) komórek HEp-2 i jest on wykrywany po
6 godz. inkubacji. Szczepy
E. coli
o typie adhezji LAL (9,4% badanych izolatów)
należały do serotypu: 026 (2 szczepy), 0127 (1 szczep) oraz do szczepów nie agluty-
nujących z surowicami swoistymi dla EPEC (6 szczepów). Wszystkie LAL szczepy
posiadały gen
eae,
co potwierdził dodatni test FAS, ale nie posiadały plazmidu 60 MDa.
Spośród 25 szczepów
eae
i FAS-dodatnich, 8 (32%) wykazało rozsiany typ adhezji
(ryc.1c); 1 z tych szczepów należał do serotypu 026, pozostałe nie aglutynowały z dia­
gnostycznymi odczynnikami lateksowymi dla EPEC; 3 spośród DA szczepów (2 -
niepatogenne i 1-026) wykazały obecność plazmidu około 60 MDa. Wyniki badania
zależności pomiędzy obecnością genu
eae
oraz plazmidu EAF a serotypem i wynikiem
testu FAS przedstawiono w tabeli III. Zdolność do produkcji enterohemolizyny wyka­
zały tylko 2 szczepy
E. coli
026 - jeden o zlokalizowanym, a drugi o rozsianym typie
adhezji. Oba te szczepy poza obecnością genu eae oraz plazmidu ok. 60 MDa, posiadały
geny dla verotoksyny VT1. Pozostałe 9 szczepów, u których wykazano plazmid 60
MDa, należały do niehemolizujących. Ogółem 22 (22,9%) badane szczepy wykazały
obecność genów dla verotoksyn, pomimo, że nie stwierdzono wśród nich serotypu O157.
Zależność między obecnością genów VT1 i/lub VT2 oraz serotypem i typem adhezji
wykazano w tabeli IV. Wśród 27 (28,1%) szczepów NA wykazano duże zróżnicowanie
pod względem serotypów i obecności fimbrii; żaden szczep z tej grupy nie posiadał
genu
eae,
genów dla verotoksyn lub plazmidu 60 MDa (tab. I). Spośród 6 szczepów
CDEC (ryc.1d), połowa należała do serotypu 018 i posiadała fimbrie typu MR oraz
tylko jeden plazmid o wysokim ciężarze cząsteczkowym (ok. 30 MDa). Podobnie jak
w przypadku szczepów nieadherentnych, nie wykazano w tej grupie obecności genów:
stxl, stx2, eae
lub plazmidu 60 MDa. Wyniki badań szczepów CDEC wykazano w tabeli
V.
Nr 3
Typy ahezji
E. coli
291
Ta b e 1 a II. Serotypy, fimbrie oraz typy adhezji szczepów
E. coli
izolowanych z próbek kału
od dzieci z biegunką
Ta b 1 e II.
Serotypes, fimbria and adherence patterns of
E. coli
strains isolated from stool
samples of children with diarrhea
Serotyp
Liczba
szczepów
9
9
4
4
4
4
3
2
2
2
1
1
1
Fimbrie
Typ adhezji
brak
5
2
2
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
MS
4
1
1
3
3
2
3
1
2
2
1
1
0
MR
0
6
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
LA
6
0
0
0
1
1
0
0
0
0
1
0
0
LAL
2
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
DA
1
5
0
1
1
2
2
0
1
1
0
1
0
NA
0
1
4
2
2
CDEC
0
3
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
026
018
044
0125
OH4
Szorstkie
086
0127
OH9
025
0111
0128
0124
Niepato-
genne
0
0
1
50
9
38
3
0
6
30
12
2
Razem
96
(100%)
22
(23%)
62
(64,5%)
12
(12,5%)
9
(9,4%)
9
(9,4%)
45
(46,85%)
27
(28,1%)
6
(6,25%)
NA - nieadherentne szczepy, pozostałe objaśnienia tabeli w tekście
Ta b e 1 a III. Zależność między serotypem, typem adhezji a wynikiem testu FAS i obecnością
genu
eae,
badanych szczepów
E. coli
Ta b 1 e III. The dependence of serotype and pattern of adherence upon the FAS test result
and the presence of
eae
gene of examined
E, coli
strains
np - szczep niepatogenny
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
  • zanotowane.pl
  • doc.pisz.pl
  • pdf.pisz.pl
  • cs-sysunia.htw.pl